大家好这里是专注表观组学十余年领跑多组学科研服务的易基因2026年3月27日华南理工大学王迎军院士、施雪涛教授、柴牧原助理研究员团队合作在《Bioactive Materials》期刊发表题为“Epigenetic reprogramming periosteum promotes aging critical segmental bone defect repair via methylation remodeling”高水平科研成果。研究针对衰老人群中常见的临界节段性骨缺损CSBDs修复困难这一临床难题创新性地开发了一种基于表观遗传重编程的人工骨外膜BFVs-loaded periosteum该材料可以通过调控DNA甲基化水平改善衰老临界节段性骨缺损CSBDs修复过程中不良的骨微环境和炎症微环境。本研究开发的人工骨外膜采用三层结构通过负载幼年小鼠骨折源性细胞外囊泡BFVs表现出稳定的BFV释放性能14天内持续稳定释放及优异的拉伸性能模量约0.22 MPa断裂伸长率约200%。体外实验表明BFV负载骨外膜的提取液可显著降低衰老骨髓间充质干细胞BMSCs中的衰老标志物β-gal、γH2A.x、p16、p21水平同时促进成骨分化。同时该材料还可调控巨噬细胞向抗炎M2表型极化并抑制破骨细胞形成。在衰老小鼠股骨CSBDs模型中BFV负载骨外膜联合3D打印支架维持了植入物结构完整性并显著增强骨再生修复效果达到与成年小鼠相当的水平。更重要的是该研究通过简化基因组DNA甲基化测序RRBS揭示BFVs负载骨外膜通过促进基因体genebody区域的DNA甲基化重塑特别是上调了抗衰老关键转录因子Foxo3基因的甲基化水平从而实现对衰老骨微环境的表观遗传重编程进而逆转骨骼衰老。该骨外膜有效连接3D打印支架与宿主骨之间的力学适配性同时通过表观遗传调控逆转衰老骨微环境为衰老骨骼损伤的治疗提供了前景广阔的策略。DOI:10.1016/j.bioactmat.2026.03.036英文标题Epigenetic reprogramming periosteum promotes aging critical segmental bone defect repair via methylation remodeling译文标题表观遗传重编程骨外膜通过甲基化重塑促进衰老临界性骨缺损修复发表时间2026年3月27日发表期刊生物活性材料Bioactive Materials影响因子IF20.3/Q1技术平台RRBS作者单位华南理工大学研究亮点一种生物活性骨外膜将衰老小鼠临界节段性骨缺损的修复能力恢复至成年小鼠水平。该生物活性骨外膜通过调控干细胞和巨噬细胞改善衰老骨微环境。功能机制研究揭示该生物活性骨外膜通过基因体DNA甲基化重塑实现表观遗传重编程。图形摘要研究方法1材料构建与表征BFVs提取与鉴定从幼年小鼠骨折模型血清中提取细胞外囊泡BFVs。通过透射电子显微镜TEM、纳米颗粒追踪分析NTA和Western Blot对其进行形态、粒径和标志物Cd9和Cd63鉴定。人工骨外膜制备分层制备PVA牺牲层提供冻干后的硬度便于手术缝合、PCL机械支撑层增强整体力学适应性防止软组织长入和GelMA功能层负载BFVs实现缓释。在GelMA层中可选择性地负载或不负载BFVs形成P-BFVs组和P-Blank对照组骨外膜。通过紫外光交联固化GelMA层。材料表征使用扫描电子显微镜观察微观结构通过共聚焦显微镜观察BFVs分布在模拟体液中测定BFVs的体外释放曲线共14天使用万能材料试验机测量其拉伸力学性能拉伸模量、断裂伸长率等。3D打印支架设计与制备设计并打印两种β-磷酸三钙β-TCP生物陶瓷支架分别用于体外细胞实验和体内股骨CSBD模型。2体外细胞实验细胞模型从20月龄衰老模型C57BL/6小鼠股骨中分离原代衰老BMSCsRAW 264.7细胞系作为巨噬细胞极化研究模型。功能评估CCK-8检测细胞增殖ALP、ARS染色评估成骨分化SA-β-gal染色评估细胞衰老流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2极化和ROS水平TRAP染色评估破骨细胞形成。基因与蛋白表达qPCR检测衰老、成骨、炎症、破骨相关基因Il6, P16, Runx2, Col1, Tnfα, Trap等的mRNA表达免疫荧光和免疫组化检测相关蛋白β-gal, γH2A.x, Runx2, Col1, Foxo3表达。3动物实验衰老小鼠CSBDs模型模型构建在18月龄衰老和6月龄成年C57BL/6小鼠股骨上构建临界性骨缺损模型。分组干预分为MS组仅3D打印支架、MSP-Blank组成年小鼠支架无BFVs骨外膜、SSP-Blank组衰老小鼠支架无BFVs骨外膜、SSP-BFVs组衰老小鼠支架BFVs骨外膜。体内示踪使用DiD标记BFVs通过IVIS小动物活体成像系统监测其在体内的分布。疗效评估植入12周后通过micro-CT对骨痂进行三维重建和定量分析通过HE、Masson染色评估新生骨组织和材料整合情况。4表观遗传学与机制验证RRBS测序分析提取SSP-Blank和SSP-BFVs两组CSBDs愈合组织骨痂的DNA进行RRBS甲基化测序并鉴定差异甲基化区域DMRs、分析甲基化在启动子/基因体等不同功能区的分布特征、对差异甲基化基因进行GO和KEGG富集分析。靶点验证通过qPCR、IF和IHC验证关键基因Foxo3的表达使用siRNA沉默Foxo3通过功能挽救实验验证其对材料疗效的必要性。关键结果1负载BFVs的骨外膜构建与表征研究人员成功构建了由PVA、PCL和GelMA组成的三层结构人工骨外膜。其中GelMA功能层内均匀分布着从幼年小鼠骨折血清中提取的BFVs。扫描电镜清晰地展示了其冻干状态下的三层结构。释放曲线显示BFVs能够从GelMA层中持续释放长达14天初期有少量突释随后进入平稳缓释阶段总释放率接近80%为长效调控衰老微环境提供了基础。图1图1BFVs负载骨外膜材料的构建、表征及拉伸力学性能2基于RRBS测序的衰老小鼠CSBD骨痂表观遗传学分析为揭示深层机制研究者对SSP-BFVs组和SSP-Blank组的CSBD愈合组织骨痂组织进行了RRBS测序。结果显示两组之间存在显著的DNA甲基化差异特别是在CpG位点鉴定出174个高甲基化基因和24个低甲基化基因。这些CpG DMRs的片段长度主要分布在200-400bp之间图2并表现出全基因组范围内的甲基化水平差异图3。对DMRs的基因组区域分布分析发现与启动子区域的甲基化差异不显著相比基因体genebody区域的甲基化水平在SSP-BFVs组中表现出显著的升高趋势尤其是在外显子区域这提示BFVs可能通过增加基因体甲基化来调控基因表达从而促进衰老组织的修复图4A。这表明该材料的表观调控作用可能通过调控基因体甲基化水平来影响转录延伸和剪接效率从而实现对复杂基因网络的精细调控。这一发现是理解其逆转衰老作用的全新视角。图2RRBS鉴定出的DMRs图3CpG位点的DMRs圈图图4基于RRBS测序的生信分析及关键高甲基化基因Foxo3的鉴定3Foxo3基因甲基化水平升高可能是负载BFVs骨外膜改善衰老骨微环境的关键基于RRBS测序数据结合GO和KEGG通路富集分析图4C-D研究者聚焦于基因体区域高甲基化的关键基因——Forkhead Box O3 (Foxo3)该基因与细胞衰老、氧化应激和成骨分化密切相关图4B。体外qPCR和IF实验证实P-BFVs提取物能显著促进衰老BMSCs和RAW264.7细胞中Foxo3的mRNA和蛋白表达图4E-J。体内IHC染色也显示SSP-BFVs组骨痂内细胞的Foxo3表达显著高于SSP-Blank组图4K。这些结果揭示BFVs骨外膜通过增加Foxo3基因体的甲基化水平促进其稳定表达从而发挥下游一系列抗衰老和促修复功能图5。图5RRBS数据中与Foxo3基因相关的GO和KEGG富集分析揭示其在髓系细胞分化和骨髓系细胞稳态中的关键调控作用表明其在多种病理生理过程中的重要性3Foxo3基因甲基化水平升高可能是负载BFVs骨外膜改善衰老骨微环境的关键基于RRBS测序数据结合GO和KEGG通路富集分析图4C-D研究者聚焦于基因体区域高甲基化的关键基因——Forkhead Box O3 (Foxo3)该基因与细胞衰老、氧化应激和成骨分化密切相关图4B。体外qPCR和IF实验证实P-BFVs提取物能显著促进衰老BMSCs和RAW264.7细胞中Foxo3的mRNA和蛋白表达图4E-J。体内IHC染色也显示SSP-BFVs组骨痂内细胞的Foxo3表达显著高于SSP-Blank组图4K。这些结果揭示BFVs骨外膜通过增加Foxo3基因体的甲基化水平促进其稳定表达从而发挥下游一系列抗衰老和促修复功能图5。图6BFVs负载骨外膜在缓解siFoxo3对原代衰老BMSCs和RAW 264.7细胞影响中的作用结论和启示本研究成功开发了一种具有表观遗传重编程能力的负载BFVs人工骨外膜该系统能与3D打印支架协同通过上调基因体DNA甲基化水平特别是激活Foxo3这一“长寿基因”系统性逆转衰老骨微环境的病理状态使衰老小鼠骨修复能力恢复至成年小鼠水平。RRBS测序在本研究中的重要作用全基因组甲基化图谱绘制。系统描绘了衰老CSBDs骨痂在负载BFVs人工骨外膜干预后的DNA甲基化组变化鉴定出174个CpG高甲基化基因和24个低甲基化基因为后续机制研究提供数据资源。关键调控区域的精准定位。本研究RRBS数据揭示该材料的主要表观遗传效应发生在基因体区域而非启动子区域拓展了对生物材料表观遗传调控模式的认知。关键靶基因的筛选与验证。成功筛选出Foxo3作为关键调控因子并通过甲基化抑制剂实验和siRNA功能挽救实验完成从“相关性”到“因果性”的机制验证闭环。为生物材料设计提供表观遗传学理论基础。建立“材料-DNA甲基化重塑-关键基因表达-细胞功能逆转”的完整证据链为下一代具有表观遗传调控功能的智能生物材料设计提供分子靶点和理论依据。参考文献Zheng J, Ke J, Wu S, Lan Y, Zhong Z, Yang S, Zhao N, Wang Z, Chai M, Shi X, Wang Y. Epigenetic reprogramming periosteum promotes aging critical segmental bone defect repair via methylation remodeling. Bioact Mater. 2026 Aug;62:759-775. doi: 10.1016/j.bioactmat.2026.03.036.
