拓冰网站定制 
作者Evil Genius大家平时有空多看看文献看看最前沿都在干什么以及有什么突破的医疗技术。今日分享文献现在真的是得多组学得天下。Graphical Abstract图形摘要Mining Tumor Antibodies挖掘肿瘤抗体NSCLC肿瘤经PD-1阻断治疗后肿瘤内出现富含浆细胞的三级淋巴结构TLS通过单细胞测序对肿瘤浆细胞进行BCR挖掘重组抗体发现PC-1 mAbTranslational Application转化应用PC-1识别肿瘤细胞和髓系细胞表面的瓜氨酸化抗原PC-1 CAR T细胞消除肿瘤和抑制性髓系细胞内源性肿瘤体液免疫可被挖掘用于发现抗体靶点并开发下一代免疫疗法Highlights亮点PD-1阻断与肿瘤特异性抗体开发相关单细胞BCR挖掘识别肿瘤选择性抗体谱系肿瘤抗体结合癌症细胞和促肿瘤髓系细胞上的瓜氨酸化抗原PC-1 CAR T细胞靶向肿瘤和促肿瘤髓系细胞无脱靶毒性摘要背景肿瘤浸润B细胞TIL-Bs在免疫检查点阻断背景下对抗肿瘤反应的作用尚不完全清楚。方法研究团队分析了接受新辅助PD-1阻断治疗的非小细胞肺癌NSCLC患者切除肿瘤中的体液免疫反应。主要发现肿瘤组织形成含有CD138⁺浆细胞的三级淋巴结构TLS利用体细胞超突变和类别转换的B细胞受体BCR克隆重组单克隆抗体mAbs多个mAbs结合细胞表面瓜氨酸化蛋白这是癌细胞的典型特征领先候选抗体PC-1的scFv重定向的CAR T细胞在体内特异性靶向肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞无脱靶活性在荷瘤小鼠中敲除瓜氨酸化酶PADI2可消除对PC-1的反应性和CAR的细胞毒性杀伤结论肿瘤浸润浆细胞具有治疗潜力可用于癌症治疗。引言TIL-Bs的重要性越来越多证据表明TIL-Bs在抗肿瘤免疫反应和阻碍肿瘤进展中起重要作用TIL-Bs发挥多种作用向T细胞呈递抗原、调节T细胞功能、分泌抗肿瘤抗体TIL-Bs与多种癌症软组织肉瘤、胰腺导管腺癌、NSCLC的生存改善相关PD-1阻断与B细胞PD-1免疫检查点阻断的经典机制是促进抗肿瘤T细胞反应新兴证据表明PD-L1阻断也影响B细胞反应新辅助PD-1阻断试验报告NSCLC切除标本中TLS成熟度和丰度增加TLS丰度增加与主要病理缓解和无病生存相关肿瘤内CD138⁺浆细胞频率增加与PD-1阻断后临床结局改善相关研究空白NSCLC患者中浸润浆细胞的抗肿瘤作用 largely unknown尽管已有TIL-Bs的图谱研究但BCR的肿瘤抗原特异性研究较少CAR T细胞治疗的挑战实体瘤包括NSCLC的CAR T治疗正在积极研究关键挑战识别具有足够肿瘤限制性的抗原以最小化on-target, off-tumor毒性髓系细胞和成纤维细胞驱动的免疫抑制是障碍研究思路抗PD-1治疗的肿瘤中浆细胞积累可能是肿瘤细胞特异性抗体的丰富来源利用NSCLC患者肿瘤样本通过高通量技术测序TIL-B BCR基因定义TIL-B群体选择BCR序列进行功能表征开发PC-1 CAR T构建体证明其杀伤肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞而无脱靶效应结果一、PD-1阻断后NSCLC肿瘤中浆细胞积累临床 trial 背景研究基于TOP1501临床试验NCT02818920单臂II期研究评估pembrolizumab在临床IB、II或IIIA期NSCLC患者手术切除前的疗效该 trial 证明了安全性和可行性以及令人鼓舞的主要病理缓解、无进展生存期和总生存期样本选择从该研究中具有足够库存样本的手术切除肺肿瘤中鉴定出5例切除后肿瘤标本这些标本在流式细胞分析中存在TIL-Bs并且有足够的库存样本用于研究样本类型石蜡包埋肿瘤患者001、004、006解离肿瘤患者004、201、301研究动机TIL-Bs与多种癌症包括NSCLC的生存改善相关PD-1阻断影响B细胞反应因此研究首先试图确定PD-1阻断如何增强NSCLC中的肿瘤内体液免疫反应结果二、PD-1阻断后NSCLC肿瘤中TLS形成方法使用CODEX多重免疫荧光 assay研究TLS密度和免疫细胞组成分析了3例有石蜡包埋组织可用的患者001、004、006的治疗后NSCLC切除标本包括患者004的治疗前核心针活检标本主要发现与患者004的治疗前活检相比3例患者治疗后的切除肿瘤均含有大量TLS包括成熟TLS含有GC CD4⁺ T细胞和Ki67⁺CD20⁺ B细胞被CD138⁺CD38⁺ ASCs包围这表明肿瘤内TLS中T细胞和B细胞之间存在 cross-talk以及随后的TIL-B多样化和ASC生成此外观察到CD138⁺CD38⁺ ASCs在肿瘤 stroma 和 parenchyma 中普遍积累暗示这些细胞在TME中的作用尚未充分研究TLS成熟度分析通过细胞类型邻域分析TLS内的细胞被分组为空间连贯的斑块TLS成熟度由B细胞富集和Ki67表达增殖活性标志定义分为三组未成熟immature静息成熟quiescent mature增殖成熟proliferating mature如预期增殖成熟TLS中Ki67表达高于静息成熟和未成熟TLS不同标本间TLS成熟状态差异不大与病理缓解率也无关联可能与手术切除标本的采样变异性有关结论PD-1阻断背景下的TME可能促进支持肿瘤B细胞发育的环境结果三、NSCLC中总TIL-B细胞群体的单细胞谱分析背景成熟TLS的存在暗示了抗原驱动的阳性选择和TIL-B分化方法使用scRNA-seq和BCR测序对TIL-B群体进行高分辨率表征主要发现鉴定出7个主要B细胞clusterNaive-like BActivated naive BCycling BGerminal Center (GC) BMemory B (MBC)Atypical Memory (AtM) BAntibody-secreting cells (ASCs)这些群体显示了与先前发表研究对应的基因表达谱Naive-like BTCL1A、YBX3、FCER、IGHD富集Activated naive BCD83、MIR155HG、NFKB1、CD69、CD83Cycling BMKI67、STMN1、HMGB2GC BBCL6、AICDAMBCCD27、TNFRSF13BAtM BDUSP4、FCLR5、ZEB2、ITGAX (CD11c)ASCsMYDGF、JCHAIN、XBP1、MZB1基因集分析进一步验证了TIL-B注释的分子表型由于数据集中TIL-Bs数量较少未进一步细分这些群体BCR分析结合计算重建的BCR序列与注释的scRNA-seq数据获得5,281个功能性重链-轻链配对Naive-like B以IgM和IgD同种型为主GC、MBC、AtM、ASC显示多种同种型表明这些群体中发生了类别转换体细胞超突变SHMNaive-like B平均SHM频率较低GC、MBC、ASCSHM频率较高可变重链、kappa或lambda基因家族使用在TIL-B群体间无 major 差异可变重链和轻链使用在TIL-B群体间无显著差异鉴定出39个共享克隆谱系其中12个表达为重组mAbs表明NSCLC肿瘤内TIL-B分化和克隆扩增5.4 不同TIL-B细胞群体来源抗体的肿瘤反应性背景先前观察到NSCLC中PD-1阻断后肿瘤内ASCs扩增研究试图研究抗原经历过的肿瘤反应性ASCs的免疫遗传学特征方法解离肿瘤富集CD138⁺ B细胞随后对配对重链VH和轻链VL/VL基因进行BCR测序从患者004获得1,353个独特BCR克隆型从患者301获得1,671个主要发现两名患者均观察到TIL-Bs克隆扩增每个克隆型有多个成员可变重链VH、可变kappaVK和可变lambdaVL基因家族在TIL-B ASCs中最常见肿瘤来源的VH、VK和VL基因发生突变暗示这些ASCs的抗原驱动成熟肿瘤浸润ASCs主要类别转换IgG1最常见患者00460.5%患者30143.3%其次是IgA1患者00423.8%患者30113.5%重组mAb生产与测试从患者004和301生产15个重组mAbs代表最扩增的TIL-B ASC克隆型平均VH和VL突变频率分别为5.3%和3.5%HCDR3长度为15个氨基酸这些B细胞均为类别转换IgG1最常见重链和轻链基因使用多样每个抗体通过免疫荧光染色评估结合Calu-6 NSCLC细胞系细胞表面表达抗原的能力11/1573%mAbs显示不同程度的细胞表面抗原反应性扩展分析仅研究最扩增的TIL-B ASC克隆型可能遗漏其他TIL-B群体的强效抗肿瘤抗体因此又生成17个重组mAbs来自GC、MBC和AtM TIL-B群体以及12个重组mAbs来自较少克隆扩增但高度突变或高度多样化的ASC克隆谱系平均VH和VL突变频率分别为8%和5%HCDR3长度为16个氨基酸这些B细胞均为类别转换IgG1最常见重链和轻链基因使用多样每个抗体通过免疫荧光染色评估结合A549 NSCLC细胞系细胞表面抗原的能力15/2952%mAbs显示细胞表面抗原反应性表明肿瘤抗原反应性存在于抗原经历过的TIL-B群体中包括GC、记忆和AtM B细胞群体以及ASCsPC-1的选择在29个mAbs中PC-1显示最强的细胞表面反应性PC-1是ASC repertoire中最克隆扩增的谱系之一 recovered 107个成员这些数据表明在这个代表性抗体谱系中ASC谱系对肿瘤抗原的显著成熟因此选择PC-1作为领先肿瘤反应性抗体进行进一步研究结果5、瓜氨酸化波形蛋白是肿瘤抗体的常见靶点背景PC-1 mAb对Calu-6 NSCLC细胞系显示强细胞表面结合研究决定进一步研究该抗体对其他解剖来源癌细胞系细胞表面抗原的反应性主要发现PC-1结合多种解剖来源肿瘤细胞表面抗原肺、间皮瘤等通过免疫沉淀、质谱和候选优先级标准进行抗原发现PC-1结合瓜氨酸化波形蛋白citrullinated vimentin表面等离子共振分析PC-1与候选抗原的结合列出动力学和亲和力PC-1和其他肿瘤来源抗体结合环状瓜氨酸化肽CCPs的ELISAPC-1自身反应性测试针对临床相关核自身抗原的 multiplex 免疫荧光 assay4E10已知多反应性/自身反应性抗HIV-1 mAb作为阳性对照CH65抗流感血凝素mAb作为阴性对照PC-1结合多特异性评估针对23,004种人类蛋白的HuProt微阵列CDI LabsPC-1种系回复和 consensus mature 序列比对种系回复PC-1和成熟PC-1结合瓜氨酸化肿瘤抗原的ELISA补充发现PC-1也结合瓜氨酸化calreticulin、p53、Hsp90PC-1不结合环状瓜氨酸化肽CCPs序列比对未揭示明显的共享线性表位研究推测瓜氨酸化暴露或稳定了共享的构象特征而非作为唯一结合决定因素尽管PC-1对瓜氨酸化波形蛋白的亲和力高于未修饰蛋白但PC-1 mAb不与环状瓜氨酸化肽反应表明瓜氨酸的存在本身并非该谱系结合的必要条件PC-1在瓜氨酸化波形蛋白上的表位定义仍是 active investigation 的领域结果6、PC-1结合患者来源的肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞方法流式细胞术分析PC-1结合新鲜解离的HGSOC肿瘤4例患者中的肿瘤细胞和肿瘤相关T细胞流式细胞术分析PC-1结合肿瘤相关CD4⁺或CD8⁺ T细胞CD4⁺ T细胞评估PD-1和TIM-3表达作为终末耗竭标志流式细胞术分析PC-1结合健康供体或HGSOC患者PBMCs各4例流式直方图比较PC-1结合肿瘤相关巨噬细胞CD45⁺CD14⁺DR⁺、M-MDSCsCD45⁺CD14⁺DR⁻和淋巴细胞CD3⁺CD45⁺在CTCL、NSCLC和HGSOC肿瘤中健康供体PBMCs作为对照主要发现PC-1结合HGSOC肿瘤细胞但不结合肿瘤相关T细胞PC-1结合肿瘤相关CD4⁺或CD8⁺ T细胞评估PD-1和TIM-3表达PC-1结合HGSOC患者PBMCs但不结合健康供体PBMCsPC-1结合肿瘤相关巨噬细胞和M-MDSCs但不结合淋巴细胞结果7、PC-1 CAR T细胞在免疫competent小鼠癌症模型中显示抗肿瘤活性和改善生存体外细胞毒性CD28和4-1BB共刺激的PC-1 CAR T细胞在体外杀伤Calu-6和A427 NSCLC细胞 compared with mock-transduced controlsCalu-6细胞指数降低80%和92%A427细胞指数降低64%和60%通过Xcelligence体外细胞毒性 assay 测量体内异种移植模型在NSG异种移植模型中CD28共刺激的PC-1 CAR T细胞控制已建立的Calu-6和A427肿瘤生长 compared with mock-transduced T细胞PC-1也结合A427-bearing Rag1⁻/⁻小鼠的鼠肿瘤相关巨噬细胞和脾巨噬细胞支持使用免疫competent模型评估活性和潜在毒性PAD2依赖性生成PAD2缺陷的A427细胞PAD2缺失使PC-1表面结合从亲本A427细胞的82.6%降至6.4%PAD2缺失消除了CD28或4-1BB共刺激的PC-1 CAR T细胞的杀伤这些数据支持PAD2依赖性瓜氨酸化细胞表面抗原是PC-1 CAR T细胞的功能相关靶点免疫competent小鼠模型人和鼠波形蛋白共享97%同一性包括精氨酸残基的保守为测试鼠癌症能否将瓜氨酸化波形蛋白转运到肿瘤相关髓系细胞表面用orthotopic ID8-Defb29/Vegfa肿瘤挑战B6小鼠这是团队生成的腹水模型为在免疫competent环境中评估PC-1 CAR T活性生成鼠源化CD28共刺激CAR T细胞使用PC-1 VH和VL CDR序列整合到高度相似的IGHV1-8001/IGHJ101; IGKV8-3001/IGKJ203 IgG1骨架** 中以防止体内中和使用PC-1抗体的鼠源化scFv生成CD28共刺激小鼠CAR T细胞使用 conventional 人类CAR T细胞信号基序的鼠对应物鼠源化PC-1 CAR T细胞在体外杀伤鼠KPM和UPK10肿瘤细胞细胞指数分别降低65%和44%讨论TME与PC-1结合特性TME提供慢性炎症微环境特征是持续细胞应激、细胞死亡、缺氧、髓系激活和组织重塑这可能解释为什么PC-1识别癌细胞和癌症相关免疫/基质细胞但对配对正常组织或健康供体PBMCs结合有限PC-1交叉反应机制PC-1与瓜氨酸化波形蛋白、calreticulin、p53和Hsp90交叉反应的机制尚未解决这种表型与先前报道的卵巢癌和黑色素瘤中多反应性肿瘤抗原反应性抗体一致这种多反应性可能有利于克服肿瘤内和肿瘤间的抗原多样性序列比对未揭示明显的共享线性表位PC-1不结合环状瓜氨酸化肽研究怀疑瓜氨酸化暴露或稳定了共享的构象特征而非作为唯一结合决定因素尽管PC-1对瓜氨酸化波形蛋白的亲和力高于未修饰蛋白但PC-1 mAb不与环状瓜氨酸化肽反应表明瓜氨酸的存在本身并非该谱系结合的必要条件PC-1在瓜氨酸化波形蛋白上的表位定义仍是 active investigation 的领域CAR T开发挑战与PC-1的优势免疫检查点阻断的持久反应仅限于部分患者辅助疗法如CAR T细胞治疗正在研究作为实体瘤包括NSCLC的有吸引力的策略CAR T可以重定向自体T细胞对抗肿瘤相关表面抗原绕过内源性抗原呈递介导对恶性细胞的直接细胞毒性CAR T开发的关键挑战识别具有足够肿瘤特异性的抗原以最小化毒性此外髓系细胞和成纤维细胞驱动的免疫抑制是有效肿瘤内T细胞积累、效应活性和长期持久性的 substantial barrier值得注意的是PC-1的靶点瓜氨酸化波形蛋白不仅在肿瘤细胞表面表达也在促肿瘤髓系细胞表面表达当开发成携带PC-1 mAb特异性的CAR T构建体时该构建体也杀伤肿瘤和促肿瘤髓系细胞且无有害脱靶效应提供了强有力的概念验证数据支持挖掘肿瘤抗体 repertoire 用于开发新型肿瘤治疗剂总结研究提供了TIL-B反应的计算分析平台能够快速、高通量、抗原不可知地分离肿瘤反应性抗体证明了异质性TIL-B群体中存在肿瘤抗原反应性这些群体作为抗肿瘤体液免疫反应的一部分发展更重要的是识别患者来源mAbs及其 cognate 抗原可能有助于开发新的肿瘤疗法如抗体-药物偶联物和CAR T细胞并作为未来癌症疫苗平台的候选肿瘤抗原研究局限性研究受限于临床标本数量少新辅助检查点阻断后残留组织和浆细胞浸润有限组织可用性有限也妨碍了系统分析配对 adjacent normal lung tissue 或引流淋巴结作为前体B细胞潜在来源由于从 selected clonally expanded、高度突变或多样化的BCR谱系生产抗体方法可能低估了肿瘤反应性TIL-B特异性的 full diversity无法确定研究的抗体分泌细胞是在肿瘤内TLS中产生还是从系统循环迁移到TME由于治疗研究聚焦于肿瘤来源抗体的Fc非依赖性应用未评估Fc依赖性效应功能如ADCC或ADCP尽管 extensive efforts未能解析PC-1与瓜氨酸化波形蛋白结合的结构可能与抗原的构象灵活性有关尽管有这些局限性发现支持肿瘤内BCR repertoire作为具有治疗潜力抗体的丰富来源方法部分6.1 Key Resources Table关键资源表人类样本PBMCs、血浆、卵巢癌单细胞悬液、NSCLC胸腔积液化学品、肽和重组蛋白链霉亲和素-HRP、CellMask、DAPI、重组波形蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、p53、calreticulin、HSP90α、PAD2等关键商业 assay重组mAb生产、人类蛋白微阵列、肿瘤解离试剂盒、CCP ELISA、ANA kit等软件和算法ImageJ、CellRanger、Seurat、Harmony、Azimuth、scRepertoire、Clonalyst、Change-O、IgBlast、Alakazam、Shazam、FlowJo、GraphPad Prism、BiaControl/BiaEvaluation、HKL2000、PHENIX、AbEpiTope-1.0、AlphaFold36.2 Experimental Model and Study Participants实验模型和研究参与者人类样本TOP1501临床试验NCT02818920单臂、三中心II期试验35例IB、II、IIIA期NSCLC患者接受新辅助 pembrolizumab患者接受2周期200mg静脉 pembrolizumab 后手术IRB# Pro00071629批准知情同意正常组织微阵列CHTN_Norm3购自Mid-Atlantic Cooperative Tissue Network小鼠模型NSG小鼠和B6小鼠Jackson LaboratoryIACUC protocol# A011-23-01每实验至少3个重复数据来自至少2个实验、6只小鼠细胞系人类Calu-6、A549、H1703、A427NSCLC、OvCar3卵巢、Hec1a子宫鼠KPM肺癌、UPK10卵巢癌Phoenix-AMPHO、293T、Exp293F6.3 Method Details方法细节肿瘤样本收集和处理Miltenyi Biotec人类肿瘤解离试剂盒GentleMACs设备CODEX多重成像验证的CODEX抗体面板循环剥离、退火、成像转录组数据生成CD138或CD19 MicroBeads磁标记10x Chromium Single-cell 5和V(D)J文库构建重组抗体生产GenScript TurboCHO转染 pipelineProtein-A纯化ELISA纯化蛋白包被抗体 serial dilutionHRP检测免疫荧光染色Calu-6或A549细胞Alexa Fluor 488标记抗人IgG共聚焦显微镜和图像分析Leica SP5或SP840x油镜结构研究蛋白表达p53、CALR结构域、PC-1 Fab在E. coli或哺乳动物细胞中表达蛋白纯化HisTrap、Superdex 200、Talon cobalt、HiTrap Nickel等表面等离子共振Biacore T-200CM5芯片抗人IgG捕获X射线晶体学蒸汽扩散法HKL2000处理PHENIX分子置换Coot手动精修活细胞流式细胞术抗体5μg/mL4°C 20minWestern blotRIPA裂解4-20%凝胶Li-Cor Odyssey成像免疫沉淀Dynabeads抗体偶联试剂盒质谱NuPAGE Bis-TrisWaters MClass UPLCThermoFisher Fusion Lumos瓜氨酸化重组蛋白重组人PAD250mM Tris-HCl pH7.510mM CaCl25mM DTT环状瓜氨酸化肽ELISAImmunoscan CCPlus test kit核抗原抗体反应性AtheNA Multi-Lyte ANA kitHuProt微阵列23,004种全长人类蛋白1μg/mL PC-1 mAb免疫组化Roche Discovery UltrapH8.0 EDTA抗原修复CAR T构建体和转导逆转录病毒颗粒Phoenix-AMPHO细胞Lipofectamine 3000细胞毒性 assayxCELLigence系统实时监测鼠肿瘤模型flank 肿瘤Calu-6、A427腹腔肿瘤UPK10FACSDAPI viability dyeBD FACS ARIACRISPR和PAD2⁻/⁻细胞系生成tracrRNA:crRNA复合物Neon NxT电转6.4 Quantification and Statistical Analysis定量和统计分析TLS邻域聚类和斑块 delineation4个区域30个空间邻域簇密度-based层次聚类TLS成熟度分类B细胞富集40%未成熟≥40%成熟Ki67表达10%静息≥10%增殖单细胞RNA-seq数据收集、QC、整合和注释CellRanger V5/V7Seurat 5.1.0HarmonyAzimuthBCR repertoire分析Cell Ranger VDJ pipelinescRepertoireClonalystChange-OIgBlastAlakazamShazam基因集分析Seurat AddModuleScorepheatmap表位模型预测AlphaFold3AbEpiTope-1.0AbEpiScore-1.0AbEpiTarget-1.0统计分析GraphPad Prism v10Kaplan-Meierlog-ranktwo-way repeated measures ANOVASidaks multiple comparisons test总体结论研究通过单细胞BCR挖掘从PD-1阻断治疗的NSCLC患者肿瘤浸润浆细胞中发现了肿瘤特异性抗体。领先抗体PC-1识别瓜氨酸化波形蛋白等抗原这些抗原在肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞表面表达。PC-1 CAR T细胞在体外和体内均显示抗肿瘤活性且无脱靶毒性。研究证明了内源性肿瘤体液免疫可被挖掘用于发现抗体靶点和开发下一代免疫疗法为CAR T细胞治疗实体瘤提供了新的思路。生活很好有你更好 文献分享--PD-1阻断后肿瘤浸润浆细胞谱分析揭示肿瘤特异性抗体
作者Evil Genius大家平时有空多看看文献看看最前沿都在干什么以及有什么突破的医疗技术。今日分享文献现在真的是得多组学得天下。Graphical Abstract图形摘要Mining Tumor Antibodies挖掘肿瘤抗体NSCLC肿瘤经PD-1阻断治疗后肿瘤内出现富含浆细胞的三级淋巴结构TLS通过单细胞测序对肿瘤浆细胞进行BCR挖掘重组抗体发现PC-1 mAbTranslational Application转化应用PC-1识别肿瘤细胞和髓系细胞表面的瓜氨酸化抗原PC-1 CAR T细胞消除肿瘤和抑制性髓系细胞内源性肿瘤体液免疫可被挖掘用于发现抗体靶点并开发下一代免疫疗法Highlights亮点PD-1阻断与肿瘤特异性抗体开发相关单细胞BCR挖掘识别肿瘤选择性抗体谱系肿瘤抗体结合癌症细胞和促肿瘤髓系细胞上的瓜氨酸化抗原PC-1 CAR T细胞靶向肿瘤和促肿瘤髓系细胞无脱靶毒性摘要背景肿瘤浸润B细胞TIL-Bs在免疫检查点阻断背景下对抗肿瘤反应的作用尚不完全清楚。方法研究团队分析了接受新辅助PD-1阻断治疗的非小细胞肺癌NSCLC患者切除肿瘤中的体液免疫反应。主要发现肿瘤组织形成含有CD138⁺浆细胞的三级淋巴结构TLS利用体细胞超突变和类别转换的B细胞受体BCR克隆重组单克隆抗体mAbs多个mAbs结合细胞表面瓜氨酸化蛋白这是癌细胞的典型特征领先候选抗体PC-1的scFv重定向的CAR T细胞在体内特异性靶向肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞无脱靶活性在荷瘤小鼠中敲除瓜氨酸化酶PADI2可消除对PC-1的反应性和CAR的细胞毒性杀伤结论肿瘤浸润浆细胞具有治疗潜力可用于癌症治疗。引言TIL-Bs的重要性越来越多证据表明TIL-Bs在抗肿瘤免疫反应和阻碍肿瘤进展中起重要作用TIL-Bs发挥多种作用向T细胞呈递抗原、调节T细胞功能、分泌抗肿瘤抗体TIL-Bs与多种癌症软组织肉瘤、胰腺导管腺癌、NSCLC的生存改善相关PD-1阻断与B细胞PD-1免疫检查点阻断的经典机制是促进抗肿瘤T细胞反应新兴证据表明PD-L1阻断也影响B细胞反应新辅助PD-1阻断试验报告NSCLC切除标本中TLS成熟度和丰度增加TLS丰度增加与主要病理缓解和无病生存相关肿瘤内CD138⁺浆细胞频率增加与PD-1阻断后临床结局改善相关研究空白NSCLC患者中浸润浆细胞的抗肿瘤作用 largely unknown尽管已有TIL-Bs的图谱研究但BCR的肿瘤抗原特异性研究较少CAR T细胞治疗的挑战实体瘤包括NSCLC的CAR T治疗正在积极研究关键挑战识别具有足够肿瘤限制性的抗原以最小化on-target, off-tumor毒性髓系细胞和成纤维细胞驱动的免疫抑制是障碍研究思路抗PD-1治疗的肿瘤中浆细胞积累可能是肿瘤细胞特异性抗体的丰富来源利用NSCLC患者肿瘤样本通过高通量技术测序TIL-B BCR基因定义TIL-B群体选择BCR序列进行功能表征开发PC-1 CAR T构建体证明其杀伤肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞而无脱靶效应结果一、PD-1阻断后NSCLC肿瘤中浆细胞积累临床 trial 背景研究基于TOP1501临床试验NCT02818920单臂II期研究评估pembrolizumab在临床IB、II或IIIA期NSCLC患者手术切除前的疗效该 trial 证明了安全性和可行性以及令人鼓舞的主要病理缓解、无进展生存期和总生存期样本选择从该研究中具有足够库存样本的手术切除肺肿瘤中鉴定出5例切除后肿瘤标本这些标本在流式细胞分析中存在TIL-Bs并且有足够的库存样本用于研究样本类型石蜡包埋肿瘤患者001、004、006解离肿瘤患者004、201、301研究动机TIL-Bs与多种癌症包括NSCLC的生存改善相关PD-1阻断影响B细胞反应因此研究首先试图确定PD-1阻断如何增强NSCLC中的肿瘤内体液免疫反应结果二、PD-1阻断后NSCLC肿瘤中TLS形成方法使用CODEX多重免疫荧光 assay研究TLS密度和免疫细胞组成分析了3例有石蜡包埋组织可用的患者001、004、006的治疗后NSCLC切除标本包括患者004的治疗前核心针活检标本主要发现与患者004的治疗前活检相比3例患者治疗后的切除肿瘤均含有大量TLS包括成熟TLS含有GC CD4⁺ T细胞和Ki67⁺CD20⁺ B细胞被CD138⁺CD38⁺ ASCs包围这表明肿瘤内TLS中T细胞和B细胞之间存在 cross-talk以及随后的TIL-B多样化和ASC生成此外观察到CD138⁺CD38⁺ ASCs在肿瘤 stroma 和 parenchyma 中普遍积累暗示这些细胞在TME中的作用尚未充分研究TLS成熟度分析通过细胞类型邻域分析TLS内的细胞被分组为空间连贯的斑块TLS成熟度由B细胞富集和Ki67表达增殖活性标志定义分为三组未成熟immature静息成熟quiescent mature增殖成熟proliferating mature如预期增殖成熟TLS中Ki67表达高于静息成熟和未成熟TLS不同标本间TLS成熟状态差异不大与病理缓解率也无关联可能与手术切除标本的采样变异性有关结论PD-1阻断背景下的TME可能促进支持肿瘤B细胞发育的环境结果三、NSCLC中总TIL-B细胞群体的单细胞谱分析背景成熟TLS的存在暗示了抗原驱动的阳性选择和TIL-B分化方法使用scRNA-seq和BCR测序对TIL-B群体进行高分辨率表征主要发现鉴定出7个主要B细胞clusterNaive-like BActivated naive BCycling BGerminal Center (GC) BMemory B (MBC)Atypical Memory (AtM) BAntibody-secreting cells (ASCs)这些群体显示了与先前发表研究对应的基因表达谱Naive-like BTCL1A、YBX3、FCER、IGHD富集Activated naive BCD83、MIR155HG、NFKB1、CD69、CD83Cycling BMKI67、STMN1、HMGB2GC BBCL6、AICDAMBCCD27、TNFRSF13BAtM BDUSP4、FCLR5、ZEB2、ITGAX (CD11c)ASCsMYDGF、JCHAIN、XBP1、MZB1基因集分析进一步验证了TIL-B注释的分子表型由于数据集中TIL-Bs数量较少未进一步细分这些群体BCR分析结合计算重建的BCR序列与注释的scRNA-seq数据获得5,281个功能性重链-轻链配对Naive-like B以IgM和IgD同种型为主GC、MBC、AtM、ASC显示多种同种型表明这些群体中发生了类别转换体细胞超突变SHMNaive-like B平均SHM频率较低GC、MBC、ASCSHM频率较高可变重链、kappa或lambda基因家族使用在TIL-B群体间无 major 差异可变重链和轻链使用在TIL-B群体间无显著差异鉴定出39个共享克隆谱系其中12个表达为重组mAbs表明NSCLC肿瘤内TIL-B分化和克隆扩增5.4 不同TIL-B细胞群体来源抗体的肿瘤反应性背景先前观察到NSCLC中PD-1阻断后肿瘤内ASCs扩增研究试图研究抗原经历过的肿瘤反应性ASCs的免疫遗传学特征方法解离肿瘤富集CD138⁺ B细胞随后对配对重链VH和轻链VL/VL基因进行BCR测序从患者004获得1,353个独特BCR克隆型从患者301获得1,671个主要发现两名患者均观察到TIL-Bs克隆扩增每个克隆型有多个成员可变重链VH、可变kappaVK和可变lambdaVL基因家族在TIL-B ASCs中最常见肿瘤来源的VH、VK和VL基因发生突变暗示这些ASCs的抗原驱动成熟肿瘤浸润ASCs主要类别转换IgG1最常见患者00460.5%患者30143.3%其次是IgA1患者00423.8%患者30113.5%重组mAb生产与测试从患者004和301生产15个重组mAbs代表最扩增的TIL-B ASC克隆型平均VH和VL突变频率分别为5.3%和3.5%HCDR3长度为15个氨基酸这些B细胞均为类别转换IgG1最常见重链和轻链基因使用多样每个抗体通过免疫荧光染色评估结合Calu-6 NSCLC细胞系细胞表面表达抗原的能力11/1573%mAbs显示不同程度的细胞表面抗原反应性扩展分析仅研究最扩增的TIL-B ASC克隆型可能遗漏其他TIL-B群体的强效抗肿瘤抗体因此又生成17个重组mAbs来自GC、MBC和AtM TIL-B群体以及12个重组mAbs来自较少克隆扩增但高度突变或高度多样化的ASC克隆谱系平均VH和VL突变频率分别为8%和5%HCDR3长度为16个氨基酸这些B细胞均为类别转换IgG1最常见重链和轻链基因使用多样每个抗体通过免疫荧光染色评估结合A549 NSCLC细胞系细胞表面抗原的能力15/2952%mAbs显示细胞表面抗原反应性表明肿瘤抗原反应性存在于抗原经历过的TIL-B群体中包括GC、记忆和AtM B细胞群体以及ASCsPC-1的选择在29个mAbs中PC-1显示最强的细胞表面反应性PC-1是ASC repertoire中最克隆扩增的谱系之一 recovered 107个成员这些数据表明在这个代表性抗体谱系中ASC谱系对肿瘤抗原的显著成熟因此选择PC-1作为领先肿瘤反应性抗体进行进一步研究结果5、瓜氨酸化波形蛋白是肿瘤抗体的常见靶点背景PC-1 mAb对Calu-6 NSCLC细胞系显示强细胞表面结合研究决定进一步研究该抗体对其他解剖来源癌细胞系细胞表面抗原的反应性主要发现PC-1结合多种解剖来源肿瘤细胞表面抗原肺、间皮瘤等通过免疫沉淀、质谱和候选优先级标准进行抗原发现PC-1结合瓜氨酸化波形蛋白citrullinated vimentin表面等离子共振分析PC-1与候选抗原的结合列出动力学和亲和力PC-1和其他肿瘤来源抗体结合环状瓜氨酸化肽CCPs的ELISAPC-1自身反应性测试针对临床相关核自身抗原的 multiplex 免疫荧光 assay4E10已知多反应性/自身反应性抗HIV-1 mAb作为阳性对照CH65抗流感血凝素mAb作为阴性对照PC-1结合多特异性评估针对23,004种人类蛋白的HuProt微阵列CDI LabsPC-1种系回复和 consensus mature 序列比对种系回复PC-1和成熟PC-1结合瓜氨酸化肿瘤抗原的ELISA补充发现PC-1也结合瓜氨酸化calreticulin、p53、Hsp90PC-1不结合环状瓜氨酸化肽CCPs序列比对未揭示明显的共享线性表位研究推测瓜氨酸化暴露或稳定了共享的构象特征而非作为唯一结合决定因素尽管PC-1对瓜氨酸化波形蛋白的亲和力高于未修饰蛋白但PC-1 mAb不与环状瓜氨酸化肽反应表明瓜氨酸的存在本身并非该谱系结合的必要条件PC-1在瓜氨酸化波形蛋白上的表位定义仍是 active investigation 的领域结果6、PC-1结合患者来源的肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞方法流式细胞术分析PC-1结合新鲜解离的HGSOC肿瘤4例患者中的肿瘤细胞和肿瘤相关T细胞流式细胞术分析PC-1结合肿瘤相关CD4⁺或CD8⁺ T细胞CD4⁺ T细胞评估PD-1和TIM-3表达作为终末耗竭标志流式细胞术分析PC-1结合健康供体或HGSOC患者PBMCs各4例流式直方图比较PC-1结合肿瘤相关巨噬细胞CD45⁺CD14⁺DR⁺、M-MDSCsCD45⁺CD14⁺DR⁻和淋巴细胞CD3⁺CD45⁺在CTCL、NSCLC和HGSOC肿瘤中健康供体PBMCs作为对照主要发现PC-1结合HGSOC肿瘤细胞但不结合肿瘤相关T细胞PC-1结合肿瘤相关CD4⁺或CD8⁺ T细胞评估PD-1和TIM-3表达PC-1结合HGSOC患者PBMCs但不结合健康供体PBMCsPC-1结合肿瘤相关巨噬细胞和M-MDSCs但不结合淋巴细胞结果7、PC-1 CAR T细胞在免疫competent小鼠癌症模型中显示抗肿瘤活性和改善生存体外细胞毒性CD28和4-1BB共刺激的PC-1 CAR T细胞在体外杀伤Calu-6和A427 NSCLC细胞 compared with mock-transduced controlsCalu-6细胞指数降低80%和92%A427细胞指数降低64%和60%通过Xcelligence体外细胞毒性 assay 测量体内异种移植模型在NSG异种移植模型中CD28共刺激的PC-1 CAR T细胞控制已建立的Calu-6和A427肿瘤生长 compared with mock-transduced T细胞PC-1也结合A427-bearing Rag1⁻/⁻小鼠的鼠肿瘤相关巨噬细胞和脾巨噬细胞支持使用免疫competent模型评估活性和潜在毒性PAD2依赖性生成PAD2缺陷的A427细胞PAD2缺失使PC-1表面结合从亲本A427细胞的82.6%降至6.4%PAD2缺失消除了CD28或4-1BB共刺激的PC-1 CAR T细胞的杀伤这些数据支持PAD2依赖性瓜氨酸化细胞表面抗原是PC-1 CAR T细胞的功能相关靶点免疫competent小鼠模型人和鼠波形蛋白共享97%同一性包括精氨酸残基的保守为测试鼠癌症能否将瓜氨酸化波形蛋白转运到肿瘤相关髓系细胞表面用orthotopic ID8-Defb29/Vegfa肿瘤挑战B6小鼠这是团队生成的腹水模型为在免疫competent环境中评估PC-1 CAR T活性生成鼠源化CD28共刺激CAR T细胞使用PC-1 VH和VL CDR序列整合到高度相似的IGHV1-8001/IGHJ101; IGKV8-3001/IGKJ203 IgG1骨架** 中以防止体内中和使用PC-1抗体的鼠源化scFv生成CD28共刺激小鼠CAR T细胞使用 conventional 人类CAR T细胞信号基序的鼠对应物鼠源化PC-1 CAR T细胞在体外杀伤鼠KPM和UPK10肿瘤细胞细胞指数分别降低65%和44%讨论TME与PC-1结合特性TME提供慢性炎症微环境特征是持续细胞应激、细胞死亡、缺氧、髓系激活和组织重塑这可能解释为什么PC-1识别癌细胞和癌症相关免疫/基质细胞但对配对正常组织或健康供体PBMCs结合有限PC-1交叉反应机制PC-1与瓜氨酸化波形蛋白、calreticulin、p53和Hsp90交叉反应的机制尚未解决这种表型与先前报道的卵巢癌和黑色素瘤中多反应性肿瘤抗原反应性抗体一致这种多反应性可能有利于克服肿瘤内和肿瘤间的抗原多样性序列比对未揭示明显的共享线性表位PC-1不结合环状瓜氨酸化肽研究怀疑瓜氨酸化暴露或稳定了共享的构象特征而非作为唯一结合决定因素尽管PC-1对瓜氨酸化波形蛋白的亲和力高于未修饰蛋白但PC-1 mAb不与环状瓜氨酸化肽反应表明瓜氨酸的存在本身并非该谱系结合的必要条件PC-1在瓜氨酸化波形蛋白上的表位定义仍是 active investigation 的领域CAR T开发挑战与PC-1的优势免疫检查点阻断的持久反应仅限于部分患者辅助疗法如CAR T细胞治疗正在研究作为实体瘤包括NSCLC的有吸引力的策略CAR T可以重定向自体T细胞对抗肿瘤相关表面抗原绕过内源性抗原呈递介导对恶性细胞的直接细胞毒性CAR T开发的关键挑战识别具有足够肿瘤特异性的抗原以最小化毒性此外髓系细胞和成纤维细胞驱动的免疫抑制是有效肿瘤内T细胞积累、效应活性和长期持久性的 substantial barrier值得注意的是PC-1的靶点瓜氨酸化波形蛋白不仅在肿瘤细胞表面表达也在促肿瘤髓系细胞表面表达当开发成携带PC-1 mAb特异性的CAR T构建体时该构建体也杀伤肿瘤和促肿瘤髓系细胞且无有害脱靶效应提供了强有力的概念验证数据支持挖掘肿瘤抗体 repertoire 用于开发新型肿瘤治疗剂总结研究提供了TIL-B反应的计算分析平台能够快速、高通量、抗原不可知地分离肿瘤反应性抗体证明了异质性TIL-B群体中存在肿瘤抗原反应性这些群体作为抗肿瘤体液免疫反应的一部分发展更重要的是识别患者来源mAbs及其 cognate 抗原可能有助于开发新的肿瘤疗法如抗体-药物偶联物和CAR T细胞并作为未来癌症疫苗平台的候选肿瘤抗原研究局限性研究受限于临床标本数量少新辅助检查点阻断后残留组织和浆细胞浸润有限组织可用性有限也妨碍了系统分析配对 adjacent normal lung tissue 或引流淋巴结作为前体B细胞潜在来源由于从 selected clonally expanded、高度突变或多样化的BCR谱系生产抗体方法可能低估了肿瘤反应性TIL-B特异性的 full diversity无法确定研究的抗体分泌细胞是在肿瘤内TLS中产生还是从系统循环迁移到TME由于治疗研究聚焦于肿瘤来源抗体的Fc非依赖性应用未评估Fc依赖性效应功能如ADCC或ADCP尽管 extensive efforts未能解析PC-1与瓜氨酸化波形蛋白结合的结构可能与抗原的构象灵活性有关尽管有这些局限性发现支持肿瘤内BCR repertoire作为具有治疗潜力抗体的丰富来源方法部分6.1 Key Resources Table关键资源表人类样本PBMCs、血浆、卵巢癌单细胞悬液、NSCLC胸腔积液化学品、肽和重组蛋白链霉亲和素-HRP、CellMask、DAPI、重组波形蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、p53、calreticulin、HSP90α、PAD2等关键商业 assay重组mAb生产、人类蛋白微阵列、肿瘤解离试剂盒、CCP ELISA、ANA kit等软件和算法ImageJ、CellRanger、Seurat、Harmony、Azimuth、scRepertoire、Clonalyst、Change-O、IgBlast、Alakazam、Shazam、FlowJo、GraphPad Prism、BiaControl/BiaEvaluation、HKL2000、PHENIX、AbEpiTope-1.0、AlphaFold36.2 Experimental Model and Study Participants实验模型和研究参与者人类样本TOP1501临床试验NCT02818920单臂、三中心II期试验35例IB、II、IIIA期NSCLC患者接受新辅助 pembrolizumab患者接受2周期200mg静脉 pembrolizumab 后手术IRB# Pro00071629批准知情同意正常组织微阵列CHTN_Norm3购自Mid-Atlantic Cooperative Tissue Network小鼠模型NSG小鼠和B6小鼠Jackson LaboratoryIACUC protocol# A011-23-01每实验至少3个重复数据来自至少2个实验、6只小鼠细胞系人类Calu-6、A549、H1703、A427NSCLC、OvCar3卵巢、Hec1a子宫鼠KPM肺癌、UPK10卵巢癌Phoenix-AMPHO、293T、Exp293F6.3 Method Details方法细节肿瘤样本收集和处理Miltenyi Biotec人类肿瘤解离试剂盒GentleMACs设备CODEX多重成像验证的CODEX抗体面板循环剥离、退火、成像转录组数据生成CD138或CD19 MicroBeads磁标记10x Chromium Single-cell 5和V(D)J文库构建重组抗体生产GenScript TurboCHO转染 pipelineProtein-A纯化ELISA纯化蛋白包被抗体 serial dilutionHRP检测免疫荧光染色Calu-6或A549细胞Alexa Fluor 488标记抗人IgG共聚焦显微镜和图像分析Leica SP5或SP840x油镜结构研究蛋白表达p53、CALR结构域、PC-1 Fab在E. coli或哺乳动物细胞中表达蛋白纯化HisTrap、Superdex 200、Talon cobalt、HiTrap Nickel等表面等离子共振Biacore T-200CM5芯片抗人IgG捕获X射线晶体学蒸汽扩散法HKL2000处理PHENIX分子置换Coot手动精修活细胞流式细胞术抗体5μg/mL4°C 20minWestern blotRIPA裂解4-20%凝胶Li-Cor Odyssey成像免疫沉淀Dynabeads抗体偶联试剂盒质谱NuPAGE Bis-TrisWaters MClass UPLCThermoFisher Fusion Lumos瓜氨酸化重组蛋白重组人PAD250mM Tris-HCl pH7.510mM CaCl25mM DTT环状瓜氨酸化肽ELISAImmunoscan CCPlus test kit核抗原抗体反应性AtheNA Multi-Lyte ANA kitHuProt微阵列23,004种全长人类蛋白1μg/mL PC-1 mAb免疫组化Roche Discovery UltrapH8.0 EDTA抗原修复CAR T构建体和转导逆转录病毒颗粒Phoenix-AMPHO细胞Lipofectamine 3000细胞毒性 assayxCELLigence系统实时监测鼠肿瘤模型flank 肿瘤Calu-6、A427腹腔肿瘤UPK10FACSDAPI viability dyeBD FACS ARIACRISPR和PAD2⁻/⁻细胞系生成tracrRNA:crRNA复合物Neon NxT电转6.4 Quantification and Statistical Analysis定量和统计分析TLS邻域聚类和斑块 delineation4个区域30个空间邻域簇密度-based层次聚类TLS成熟度分类B细胞富集40%未成熟≥40%成熟Ki67表达10%静息≥10%增殖单细胞RNA-seq数据收集、QC、整合和注释CellRanger V5/V7Seurat 5.1.0HarmonyAzimuthBCR repertoire分析Cell Ranger VDJ pipelinescRepertoireClonalystChange-OIgBlastAlakazamShazam基因集分析Seurat AddModuleScorepheatmap表位模型预测AlphaFold3AbEpiTope-1.0AbEpiScore-1.0AbEpiTarget-1.0统计分析GraphPad Prism v10Kaplan-Meierlog-ranktwo-way repeated measures ANOVASidaks multiple comparisons test总体结论研究通过单细胞BCR挖掘从PD-1阻断治疗的NSCLC患者肿瘤浸润浆细胞中发现了肿瘤特异性抗体。领先抗体PC-1识别瓜氨酸化波形蛋白等抗原这些抗原在肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞表面表达。PC-1 CAR T细胞在体外和体内均显示抗肿瘤活性且无脱靶毒性。研究证明了内源性肿瘤体液免疫可被挖掘用于发现抗体靶点和开发下一代免疫疗法为CAR T细胞治疗实体瘤提供了新的思路。生活很好有你更好