1. 先说清楚BRAKER2是干什么的为什么安装是道坎1.1 一段话讲明白BRAKER2的定位如果你手里有一个组装好的真核基因组比如真菌、植物或者昆虫下一步最想做的多半就是基因结构预测——也就是把基因组上的基因位置、外显子、内含子、CDS边界、蛋白序列这些信息注释出来。手动一个个看太不现实RNA-seq比对信号加同源蛋白比对信息一套交给自动注释软件去整合是当前团队最常用的做法。BRAKER2就是这个环节里非常关键的一条自动化流水线。BRAKER2的核心能力是在一条命令里完成GeneMark家族GeneMark-ES/ET/ETP和Augustus两套工具的串联。它先用RNA-seq比对产生的BAM文件或者蛋白库来训练从头预测工具然后再用训练好的参数去预测基因结构最后把结果统一输出成GFF3、蛋白序列、CDS序列等文件。相比手动分别跑GeneMark、Augustus再手工合并BRAKER2省掉的不仅是命令行次数更是中间大量容易出错的格式转换和坐标转换工作。我第一次接触BRAKER2是在一个大约40Mb的真菌基因组项目上当时已经用MAKER跑过一轮光是准备训练集和调整repeat library就花了一周。换成BRAKER2之后直接用已有的hisat2比对BAM文件--softmasking --gff3两个参数整套预测流程一天之内跑完输出结果直接进入下游功能注释流程。从那以后BRAKER2就成了我的默认工具之一。1.2 依赖链特别长安装难点从哪来BRAKER2本身其实是一堆Perl脚本真正的工作全部依赖底层的第三方工具。粗略列一下主要依赖Augustus核心基因预测器训练和预测都靠它GeneMark-ES / ET / ETP从头预测模块bamtools处理BAM文件的库和命令行工具samtools、bedtoolsBAM排序、格式处理hisat2或STARRNA-seq比对不过如果你只给BAM文件这部分只需要比对结果diamond蛋白序列快速比对用于--prot_seq模式spaln蛋白直系同源外显子比对同源注释会用到Python2环境BRAKER2部分脚本仍在Python2上运行这一步在较新系统上尤其容易出问题从这个清单你就能看出来安装BRAKER2本质上是在给一台机器配齐一整套生物信息学基础环境。难点不只在于下载安装每个软件还在于版本之间的兼容性、路径顺序、编译选项、许可文件位置任何一个环节出错最后跑braker.pl的时候都会以各种报错来考验你。所以这篇文章接下来我不会只给你复制粘贴几条命令而是会把两种安装路线、环境配置、测试验证、常见报错都走一遍按我个人反复折腾之后觉得最顺的顺序来写。2. 路线选型conda装还是源码装利弊一次说完2.1 conda安装三四条命令确实省事但也有隐藏限制如果你平时已经在用conda环境管理生信软件那装上BRAKER2最直接的方案就一条命令conda create -n braker2 -c conda-forge -c bioconda braker22.1.6注意频道顺序conda-forge放前面bioconda放后面两边冲突时以conda-forge的版本解析为准这是社区里反复验证过的顺序。装完之后进入环境conda activate braker2 which braker.pl能看到braker.pl路径说明主程序已经就位。cnda 方案最大的好处是依赖项基本由conda自动解析包括bamtools、samtools、hisat2、diamond这些都会在环境里一起装好不需要你手工指定路径。对于只想快速跑通流程的人来说这是成本最低的路线。但你必须知道它的隐藏限制GeneMark的许可组件不会通过conda自动配好。GeneMark-ES/ET系列的工具虽然会随包安装二进制文件但运行时需要用到的许可文件.gm_key仍然要你自己去官方申请。此外conda源的GeneMark版本可能不是最新某些晚期功能比如ETP模式相关的新版本工具名可能缺失。还有一点conda装的Augustus会把config目录放在conda环境内路径比较深。如果你在集群或共享机器上跑注意AUGUSTUS_CONFIG_PATH要指向环境内的config目录并且具备写权限否则训练过程中去写物种参数时会直接报错。2.2 源码安装完全可控但准备工作要做好如果你打算长期做注释项目或者需要在集群上复现一套严格可控的环境建议走源码安装。这个方案花的时间多但你能精确知道每个工具装在哪个目录、什么版本出了问题也能自己排查。我推荐的依赖安排分三层系统包层build-essential、git、cmake、wget、libgsl-dev用系统包管理器装好核心工具层Augustus、GeneMark、bamtools、samtools、bedtools、hisat2、diamond、spaln全部源码编译主程序层BRAKER2源码只需要把scripts目录加入PATH不需要unzip额外系统依赖BRAKER2的perl模块本身在源码包里都带好了只需要把路径导出到PERL5LIB。下面第3节我会把这套流程一步一步拆开。为了帮你快速判断选哪条路我给一张对比表对比项conda安装源码安装安装耗时十分钟内半天到一天依赖解析自动处理需手动逐个解决GeneMark许可仍需要手动配置仍需要手动配置版本控制依赖bioconda收录情况完全自主排错难度报错信息偏间接可直接定位编译和路径问题适用场景快速跑通、个人环境生产环境、集群复现我的建议是第一次接触就装优先conda先把BRAKER2跑通理解它的输入输出之后如果确定要大量使用再花时间整理一套源码编译环境。3. 核心装载步骤从依赖到主程序我这样装成功下面这套流程以Ubuntu 20.04为例假设用户目录是/home/user所有工具集中放在/home/user/biosoft下。3.1 Augustus与周边工具的编译细节先创建目录并下载Augustusmkdir -p ~/biosoft cd ~/biosoft git clone https://github.com/Gaius-Augustus/Augustus.git cd AugustusAugustus的编译直接make大概率能过但有两个编译选项建议提前确认ZIPINPUT是否需要支持压缩的输入文件和COMPGENEPRED是否编译另一套预测器一般在Makefile文件里以注释行存在。如果不需要额外功能默认编译就行。编译结束后重点检查几个文件bin/etrainingbin/augustusbin/autoAug.plconfig/species/下面有没有样例物种目录接下来把Augustus相关路径配好这一步在后面第4节会展开但此时先记住config目录在~/biosoft/Augustus/config后面BRAKER2必须能写这个目录。然后编译bamtools。bamtools官方推荐用cmake构建cd ~/biosoft git clone https://github.com/pezmaster31/bamtools.git cd bamtools mkdir build cd build cmake .. make sudo make install注意安装完之后bamtools的库文件可能被放在/usr/local/lib/bamtools/而头文件在/usr/local/include/bamtools/。如果你不在/usr/local下安装就记住自己的安装路径后面配置LD_LIBRARY_PATH和CMAKE_PREFIX_PATH时会用上。samtools和bedtools相对简单Ubuntu下可以直接用apt装也可以源码编译。我个人习惯源码编译samtools因为它更新频繁版本之间行为差异大。bedtools用apt装通常就够跑了。3.2 GeneMark系列许可证是绕不过去的一环GeneMark-ES/ET/ETP是BRAKER2的组成部分需要单独获取。官方下载流程是这样的到GeneMark官网的下载页面填写申请用机构邮箱注册通常几个小时内会收到一封带下载链接的邮件里面包含Linux 64位的GeneMark-ES/ET工具包和一份许可证说明。下载后把包解开放到~/biosoft/gmes_linux下并确认关键脚本存在ls ~/biosoft/gmes_linux/gmes_petap.pl接下来是全网装BRAKER2时最容易翻车的点许可证文件必须叫.gm_key放在用户主目录下。把邮件里收到的key文件内容保存到$HOME/.gm_key然后修改权限chmod 600 ~/.gm_key同时要把gmes_linux所在目录导出为环境变量GENEMARK_PATH。如果BRAKER2运行时报can not execute gmes_petap.pl或gm_key not found90%是这两处配置不对。BRAKER2主程序下载也很简单cd ~/biosoft git clone https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER.git然后只需要两步把~/biosoft/BRAKER/scripts加进PATH把~/biosoft/BRAKER/scripts导出为PERL5LIB。到这一步源码路线的安装工作基本结束接下来是配置环节。如果你选择了conda路线第3节的这些内容可以跳过一半但第4节不可以跳。4. 环境变量、权限和路径安装完成后最容易翻车的环节不管conda还是源码装以下环境变量都是BRAKER2能跑起来的先决条件。我建议把下面这段写进~/.bashrc# BRAKER2 export BRAKER2~/biosoft/BRAKER export PATH$PATH:$BRAKER2/scripts export PERL5LIB$PERL5LIB:$BRAKER2/scripts # Augustus export AUGUSTUS_CONFIG_PATH~/biosoft/Augustus/config export AUGUSTUS_BIN_PATH~/biosoft/Augustus/bin export AUGUSTUS_SCRIPTS_PATH~/biosoft/Augustus/scripts export PATH$PATH:$AUGUSTUS_BIN_PATH:$AUGUSTUS_SCRIPTS_PATH # GeneMark export GENEMARK_PATH~/biosoft/gmes_linux export PATH$PATH:$GENEMARK_PATH这几个变量缺一个运行braker.pl时都会出现说得清又说不清的报错。比如有人which augustus能看到工具但BRAKER2训练时就是找不到Augustus的配置目录通常就是因为AUGUSTUS_CONFIG_PATH没设置或者设置后没执行source ~/.bashrc。关于写权限这是最容易忽视的坑。BRAKER2会调用Augustus的new_species.pl来创建当前物种的配置目录这个动作非得在config目录下有写权限才能执行。如果你是在共享服务器上其他人装的Augustus config目录可能只有只读权限那就要自己单独拷贝一份config目录到自己的路径再指向它cp -r ~/biosoft/Augustus/config ~/biosoft/Augustus/config_my chmod -R aw ~/biosoft/Augustus/config_my export AUGUSTUS_CONFIG_PATH~/biosoft/Augustus/config_my权限问题通常不是因为故意设置而是系统用户权限隔离的原因。初期排查BRAKER2报错时先自查这三件事AUGUSTUS_CONFIG_PATH有没有指向实际存在的目录、这个目录可不可写、.gm_key在不在主目录。5. 用官方测试数据跑一遍验证安装没白费环境配置完之后不要急着跑自己的基因组先用BRAKER2自带测试数据或者一套小型的测试基因组验证一下。这样做的好处是报错了可以排除是我的数据有问题这个干扰项先把安装层面的问题清干净。5.1 测试流程与参数解释BRAKER2测试数据可以单独下载官方示例或者去BRAKER仓库的example目录找。我习惯自备一份小型基因组fasta和对应的RNA-seq比对BAM文件。推荐一个最小测试方式cd ~/biosoft/BRAKER/test braker.pl --genomegenome.fa --bamRNAseq.bam --speciesmybrakertest \ --softmasking --gff3 --cores8这条命令里每个参数都值得记牢--genomegenome.fa参考基因组建议是重复序列已经被掩蔽过的版本--bamRNAseq.bamRNA-seq reads比对到同一参考基因组后得到的BAM文件必须已按坐标排序--speciesmybrakertest给当前注释项目起的物种名Augustus会专门为这个物种名建立参数集每次注释不同物种时不要重复使用同一个名字--softmasking表示输入基因组采用软掩蔽方式重复区段用小写字母而不是N表示让预测器既能识别重复区域又保留其原始信息--gff3输出GFF3格式--cores8多线程数量根据机器核数调整如果你的数据是蛋白组而不是RNA-seq可以用--prot_seqproteins.fa替代--bamBRAKER2会走同源注释路线。运行时间取决于基因组大小、BAM深度和核心数。小测试基因组几分钟就能完成。5.2 输出文件怎么读跑完后结果默认在当前目录下一个以物种名命名的子目录里比如~/biosoft/BRAKER/test/mybrakertest/。里面最重要的几个文件braker.gff3最终的基因结构注释文件GFF3格式包含mRNA、CDS、exon等特征braker.aa预测的蛋白序列FASTA格式braker.codingseq预测的CDS序列augustus.gff3Augustus阶段的中间输出发现braker.gff3异常时可以对照看GeneMark-ET或etp相关目录GeneMark的训练和预测中间结果拿到braker.gff3后我通常会先数一下预测基因数量跟相近物种的基因数量做粗略对照。如果数量明显离谱比如一个40Mb真菌基因组预测出10万个基因那大概率是训练环节出了问题而不是安装问题。6. 实测踩坑记录从报错到定位的完整链路这里记录几类我实际装BRAKER2时遇到过的报错按排查思路写不是简单贴一条答案。6.1 bamtools的动态库找不到运行braker.pl后很快报错error while loading shared libraries: libbamtools.so.2.5.1: cannot open shared object file这种报错说明Perl脚本调用bamtools相关模块时动态库路径没被程序找到。我当时的排查思路是先用ldconfig -p | grep bamtools查系统有没有把bamtools库注册进去发现没有于是直接用LD_LIBRARY_PATH指过去export LD_LIBRARY_PATH$LD_LIBRARY_PATH:/usr/local/lib/bamtools如果你的bamtools是conda装的库路径通常在conda环境的lib目录下同样用LD_LIBRARY_PATH指过去。排查这类问题有个通用逻辑先确认二进制在哪个目录再确认它依赖什么库然后用ldd命令逐个查ldd $(which bamToWig)ldd输出里有显示not found的就是需要补路径或安装的库。6.2.gm_key许可证缺失报错报错信息类似GeneMark cannot be executed. The run failed at the point when it was executing the GeneMark-ES/ET self-training.这个报错的本质是GeneMark的许可文件没被正确放置或者GENEMARK_PATH没有指向gmes_linux目录。我遇到时第一步先检查ls -l ~/.gm_key如果没有文件就把下载好的key放过去如果有再看权限-rw-------才算正常。还有一种情况是.gm_key存在但内容不完整下载邮件里复制key内容时漏了末尾的换行或中间某一行。解决方法是重新完整复制一次许可内容。6.3 Perl模块路径缺失报错Cant locate strict vars.pm in INC (you may need to install the strict vars module)或者更常见的Cant locate module B::Hooks::EndOfScopeBRAKER2的Perl脚本依赖一批CPAN模块。源码安装方式下别忘了把$BRAKER2/scripts加入PERL5LIB因为很多模块就是自带在scripts目录里的。就算加了还报某个module缺失再用cpanm补装对应模块而不是气急败坏重装整个BRAKER2。下面是我常用的定制命令perl -MCPAN -e install B::Hooks::EndOfScopeconda安装方式下这类报错比较少因为bioconda已经把所有perl依赖都打包进去了。如果你用conda装还是报Perl模块缺失大概率是环境混了braker.pl实际调用的是base环境的Perl而不是braker2环境里的Perl。用which perl确认一下路径必须在braker2环境内。6.4 Augustus写config目录失败运行中报ERROR: The config directory /home/user/biosoft/Augustus/config does not exist or is not readable或者跑到某一步提示没法创建物种目录。这个就是权限问题按第4节的方法把config目录拷贝出来并放开写权限即可。还有一种隐藏情况AUGUSTUS_CONFIG_PATH写得不对BRAKER2在后台调用Augustus时根本没拿到这个环境变量。排查办法是直接在命令行里再看一遍echo $AUGUSTUS_CONFIG_PATH如果输出是空说明~/.bashrc里那行没生效重新执行source ~/.bashrc或者干脆从终端手动export后再跑测试。7. 从装完到投产真正跑基因组的几个建议测试跑通只是第一步真到了自己的项目上有几个点我建议提前想清楚。输入基因组最好先做重复序列掩蔽。BRAKER2对未掩蔽基因组也能跑但结果里会混入大量转座子相关预测导致基因数量虚高。我会用RepeatMasker对组装基因组做一遍soft masking小写字母表示重复区域然后再交给BRAKER2参数里保持--softmasking。如果打算用RNA-seq辅助注释BAM文件的质量比数量重要。比对工具用hisat2或STAR都可以关键是比对完要按坐标排序并建立索引samtools sort - 8 -o rnaseq.sorted.bam rnaseq.unsorted.bam samtools index rnaseq.sorted.bamBRAKER2对BAM文件的要求就是sortedindexed少了索引会报错或行为异常。关于蛋白库的选择如果走--prot_seq路线建议选覆盖度高的参考蛋白库比如OrthoDB的相应类群子集或者直接准备近缘物种的蛋白组。蛋白库不需要太大太杂反而增加spaln和diamond的比对负担拖慢整个流程。输出结果也不是终点。我拿到braker.gff3后还会用BUSCO对预测蛋白序列做一次完整性评估看核心单拷贝基因找回比例。这一步能快速判断注释质量如果BUSCO完整率远低于同类已有物种先别急着调参检查输入BAM和蛋白库可能更有效。最后如果你是在集群或容器环境里跑建议把整个安装环境打包成镜像或者固定conda环境导出文件。BRAKER2的依赖链太长了几个月后换机器重装很容易因为某个工具版本不同而出现行为差异。我用conda env export braker2_env.yml把环境完整记录下来换机器时一次性重建省心得多。