拓冰网站定制 
做转录组研究时经常会遇到两类棘手问题RNA 测序结果和实验预期不一致或者转录水平变化显著但蛋白检测结果没有对应趋势。很多科研人员遇到该问题会盲目重复实验浪费样本与时间。本文从样本取材、测序深度、比对注释、转录本、实验体系、扰动响应六个层面系统性梳理排查思路遇到 RNA 与蛋白表达不匹配的同学可以对照自查。1 样本和取材——最容易被跳过的一层先说最重要的先看样本再看测序。很多不符预期最后追回来是取材本身的问题。●组织不均一一整块组织磨出来的 RNA是里面所有细胞的平均值。比如肿瘤组织肿瘤细胞占 30% 还是 50%测出来的差异可能只是细胞比例变了不是细胞真的变了。做组织样本的最好配一张组织切片评估●细胞弄错了细胞系身份要对一遍。买错、污染、传代太多次导致性状漂移都会让结论整个跑偏——这是花五分钟能排除、却能省掉一个月的事●样本降解了RNA 放久了会断。断得厉害的样本测出来会偏 3 端本来表达正常的基因看着就像表达下降。怎么判断先做 PCA。如果同一组的样本之间差别比两组之间的差别还大别往下做差异分析了回去查样本。2 测序深度——测得不深差异是抽出来的低表达基因本来就时灵时不灵。测序量不够的时候同一个基因可能这批样本测到了、那批没测到到了差异分析里就成了假阳性或者假阴性。怎么判断挑几个你在意的基因看看它们的检出情况在重复样本里是不是一致。不一致就补测序量或者换更深的方案——别急着解读数据。3 比对和注释版本——这个基因测不到的技术原因有些基因测不到跟生物学一点关系都没有纯粹是技术问题。最常见的是参考版本不统一比如两批数据用了不同版本的注释文件新发现的转录本在老版本里根本不存在测到的读数就被丢到一个空坐标上看起来就是没表达。比对率异常低还要考虑污染或者参考序列选错了。怎么判断看一眼比对率是否正常再确认所有数据的参考版本和注释版本是不是同一套。特别是不同时间点、不同人做的数据最容易混版本。4 转录本——总量没问题功能解释不通前三层都干净了数据还是不对劲就轮到这一层。这一层最容易被漏掉。同一个基因可以做出好几种转录本。常规测序只算这个基因的总账不区分是哪几种。一个真实案例Communications BiologyIF 5.8同一批阿尔茨海默病脑组织研究者分了两路——一路用常规短读长测序算基因总量一路用长读长测序数每种转录本各占多少。结果很有意思SEPTIN4 这个基因在常规测序的差异基因列表里完全找不到。换成能分转录本的方法一看才明白——它的一种转录本在病人里明显减少另一种转录本却明显增多一个减一个加加起来正好抵消。所以从总量上看它毫无变化。研究者又用 RT-PCR 一个个样本验证过两种转录本确实都真实存在。SEPTIN4 一减一加互相抵消什么时候该往这一层查① 差异分析结果和你的表型方向相反或者该出现的基因没出现② 配对样本里总量变化解释不了功能变化③ 你研究的正好是 HER2、EGFR、MET、ALK 这类容易做出多种转录本的基因。要查这一层可以按需要选想看一个基因到底有几种转录本用全长转录组测序ONT-lrRNA-seq想同时看poly(A) 尾长和 APA 位点APA 指同一个基因在不同位置截断做出长短不一的结尾用含 poly(A) 尾全长转录组测序ONT-PAIrRNA-seq——这条路测的是尾巴看不到 RNA 修饰想看 RNA 修饰m6A/m5C 这类用直接 RNA 测序ONT-DRS想看每个细胞分别用了哪种转录本用单细胞三代全长转录组测序。5 实验体系——体系不对照样出反结论RNA 测对了体系不对结论还是错的。●细胞系差异同一条通路在两个细胞系里方向相反是很常见的事遗传背景不同。只做一个细胞系就下结论要小心●抗体对不上抗体不专一或者它识别的那一段正好在不同转录本之间有差别WB 和 IHC 的条带就会和预期不符。所以这个抗体认的是哪种转录本本身就值得先确认一下——有些转录本缺了抗体识别的位点条带自然出不来这不是实验做坏了●批次效应不同批试剂、不同人操作会把技术差别混进生物学差别里。怎么判断换一套独立体系、或者换一个识别位点不同的抗体再复现一遍。两套都做不出来这个结论先存疑。6 扰动响应——敲低没反应不一定是没敲掉这层最容易误判。敲低或给药之后表型没变化第一反应往往是没敲掉或者药没用但也可能是下面几种●代偿这个基因被压下去了通路里别的成员顶上来表型被兜住了●功能相似可替代同一家族里有几个基因干相似的活敲掉一个看不出变化●靶点根本没表达你以为它在其实它不在——这是最该先确认的一件事。怎么判断先用 qPCR 确认敲低效率再补一层蛋白证据WB或者单细胞蛋白组 AbSeq。RNA、蛋白、表型三层都对上了结论才站得住。总结就按这个顺序查样本 → 深度 → 注释 → 转录本 → 体系 → 扰动。顺序别乱前面的层出问题后面的层怎么查都查不出来。大多数不符预期在第 1、2 层就能找到原因。前三层干净、总量也对才轮到转录本。你手头有没有RNA 和蛋白对不上的经历留言说说现象。 转录组数据分析踩坑：RNA 结果与预期不符、RNA 和蛋白表达不一致，6 大方向排查方案
做转录组研究时经常会遇到两类棘手问题RNA 测序结果和实验预期不一致或者转录水平变化显著但蛋白检测结果没有对应趋势。很多科研人员遇到该问题会盲目重复实验浪费样本与时间。本文从样本取材、测序深度、比对注释、转录本、实验体系、扰动响应六个层面系统性梳理排查思路遇到 RNA 与蛋白表达不匹配的同学可以对照自查。1 样本和取材——最容易被跳过的一层先说最重要的先看样本再看测序。很多不符预期最后追回来是取材本身的问题。●组织不均一一整块组织磨出来的 RNA是里面所有细胞的平均值。比如肿瘤组织肿瘤细胞占 30% 还是 50%测出来的差异可能只是细胞比例变了不是细胞真的变了。做组织样本的最好配一张组织切片评估●细胞弄错了细胞系身份要对一遍。买错、污染、传代太多次导致性状漂移都会让结论整个跑偏——这是花五分钟能排除、却能省掉一个月的事●样本降解了RNA 放久了会断。断得厉害的样本测出来会偏 3 端本来表达正常的基因看着就像表达下降。怎么判断先做 PCA。如果同一组的样本之间差别比两组之间的差别还大别往下做差异分析了回去查样本。2 测序深度——测得不深差异是抽出来的低表达基因本来就时灵时不灵。测序量不够的时候同一个基因可能这批样本测到了、那批没测到到了差异分析里就成了假阳性或者假阴性。怎么判断挑几个你在意的基因看看它们的检出情况在重复样本里是不是一致。不一致就补测序量或者换更深的方案——别急着解读数据。3 比对和注释版本——这个基因测不到的技术原因有些基因测不到跟生物学一点关系都没有纯粹是技术问题。最常见的是参考版本不统一比如两批数据用了不同版本的注释文件新发现的转录本在老版本里根本不存在测到的读数就被丢到一个空坐标上看起来就是没表达。比对率异常低还要考虑污染或者参考序列选错了。怎么判断看一眼比对率是否正常再确认所有数据的参考版本和注释版本是不是同一套。特别是不同时间点、不同人做的数据最容易混版本。4 转录本——总量没问题功能解释不通前三层都干净了数据还是不对劲就轮到这一层。这一层最容易被漏掉。同一个基因可以做出好几种转录本。常规测序只算这个基因的总账不区分是哪几种。一个真实案例Communications BiologyIF 5.8同一批阿尔茨海默病脑组织研究者分了两路——一路用常规短读长测序算基因总量一路用长读长测序数每种转录本各占多少。结果很有意思SEPTIN4 这个基因在常规测序的差异基因列表里完全找不到。换成能分转录本的方法一看才明白——它的一种转录本在病人里明显减少另一种转录本却明显增多一个减一个加加起来正好抵消。所以从总量上看它毫无变化。研究者又用 RT-PCR 一个个样本验证过两种转录本确实都真实存在。SEPTIN4 一减一加互相抵消什么时候该往这一层查① 差异分析结果和你的表型方向相反或者该出现的基因没出现② 配对样本里总量变化解释不了功能变化③ 你研究的正好是 HER2、EGFR、MET、ALK 这类容易做出多种转录本的基因。要查这一层可以按需要选想看一个基因到底有几种转录本用全长转录组测序ONT-lrRNA-seq想同时看poly(A) 尾长和 APA 位点APA 指同一个基因在不同位置截断做出长短不一的结尾用含 poly(A) 尾全长转录组测序ONT-PAIrRNA-seq——这条路测的是尾巴看不到 RNA 修饰想看 RNA 修饰m6A/m5C 这类用直接 RNA 测序ONT-DRS想看每个细胞分别用了哪种转录本用单细胞三代全长转录组测序。5 实验体系——体系不对照样出反结论RNA 测对了体系不对结论还是错的。●细胞系差异同一条通路在两个细胞系里方向相反是很常见的事遗传背景不同。只做一个细胞系就下结论要小心●抗体对不上抗体不专一或者它识别的那一段正好在不同转录本之间有差别WB 和 IHC 的条带就会和预期不符。所以这个抗体认的是哪种转录本本身就值得先确认一下——有些转录本缺了抗体识别的位点条带自然出不来这不是实验做坏了●批次效应不同批试剂、不同人操作会把技术差别混进生物学差别里。怎么判断换一套独立体系、或者换一个识别位点不同的抗体再复现一遍。两套都做不出来这个结论先存疑。6 扰动响应——敲低没反应不一定是没敲掉这层最容易误判。敲低或给药之后表型没变化第一反应往往是没敲掉或者药没用但也可能是下面几种●代偿这个基因被压下去了通路里别的成员顶上来表型被兜住了●功能相似可替代同一家族里有几个基因干相似的活敲掉一个看不出变化●靶点根本没表达你以为它在其实它不在——这是最该先确认的一件事。怎么判断先用 qPCR 确认敲低效率再补一层蛋白证据WB或者单细胞蛋白组 AbSeq。RNA、蛋白、表型三层都对上了结论才站得住。总结就按这个顺序查样本 → 深度 → 注释 → 转录本 → 体系 → 扰动。顺序别乱前面的层出问题后面的层怎么查都查不出来。大多数不符预期在第 1、2 层就能找到原因。前三层干净、总量也对才轮到转录本。你手头有没有RNA 和蛋白对不上的经历留言说说现象。