无细胞蛋白表达应用案例：eProtein Discovery实现BTK抑制剂5天筛选与功能表征

摘要

英国Nuclera公司的eProtein Discovery是一套无细胞蛋白表达筛选（CFPS）系统，也可理解为体外转录/翻译平台，能够在较短时间内完成从DNA到功能性蛋白的表达与筛选流程。本文基于BTK激酶抑制剂研究案例，介绍eProtein Discovery联用Biacore SPR技术的整体工作流程，包括BTK蛋白表达优化、Avi标签筛选、生物素化修饰以及SPR动力学分析等内容，实现从DNA到蛋白功能表征仅需约5天，为激酶类药物研发提供更高效的工作流程参考。

关键词：无细胞蛋白表达、CFPS、BTK抑制剂、Biacore SPR、eProtein Discovery、蛋白表达筛选、激酶药物研发、蛋白功能表征、Avi标签、生物素化

一、无细胞蛋白表达系统在BTK抑制剂研究中的应用背景

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是B细胞受体信号通路中的关键分子，也是目前白血病、淋巴瘤以及自身免疫性疾病研究中的重要药物靶点。随着BTK抑制剂不断发展，研究重点已经从单纯获得抑制活性，逐步转向更高选择性、更低脱靶效应以及更优动力学特征的综合优化。

第一代BTK抑制剂虽然已经成功应用于临床，但仍面临耐药突变以及脱靶问题；第二代BTK抑制剂在选择性方面有所改善，但在生物利用度以及耐药性方面依然存在局限。近年来，非共价BTK抑制剂逐渐成为研究热点，但由于其结合具有可逆性，因此需要更加详细的动力学分析来评估其药物潜力。

在这一背景下，快速获得高质量功能蛋白，并进一步完成动力学表征，成为BTK药物研发中的重要环节。

二、Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达系统简介

Nuclera公司的eProtein Discovery是一套基于数字微流控与无细胞蛋白合成技术构建的自动化蛋白表达筛选平台，可实现快速蛋白表达优化与条件筛选。系统能够同时筛选多达24种可溶性蛋白或11种膜蛋白，并针对每种蛋白同时测试多组表达条件，从而快速获得更适合后续研究的表达方案。

该系统能够在48小时内实现从DNA到活性蛋白的表达筛选，并进一步结合Biacore SPR技术，在约5天内完成从蛋白表达、纯化到功能表征的完整流程。对于需要快速优化蛋白构建体、筛选标签或评估表达条件的研究场景，无细胞蛋白表达系统能够明显缩短整体研发周期。

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三、BTK抑制剂筛选整体工作流程

本研究中，首先利用eProtein Discovery系统对BTK蛋白进行无细胞表达条件筛选，包括不同蛋白构建体、不同可溶性标签以及不同无细胞混合体系（Cell-free Blends）的组合筛选。在获得最佳表达方案后，对目标蛋白进行规模放大生产，并进一步完成生物素化修饰。

随后，通过缓冲液交换去除多余生物素，并利用Biacore SPR系统将生物素化BTK蛋白捕获到Sensor Chip SA芯片上，最终完成BTK与不同抑制剂之间的动力学分析。

图1：5天工作流程实现从DNA到蛋白质表征

这一流程能够在较短时间内完成从DNA设计到药物靶点功能分析的完整过程，对于需要快速验证蛋白构建体以及药物结合特性的研究具有较高应用价值。

四、利用无细胞蛋白表达系统筛选BTK最佳构建体

研究人员首先设计了三种BTK构建体，包括全长BTK（1-693）、截短变体（211-659）以及仅包含激酶结构域的BTK392-659。随后利用eProtein Discovery系统，在不同可溶性标签以及不同无细胞表达条件下，对这些构建体进行表达筛选与纯化评估。

实验结果显示，仅包含激酶结构域的BTK392-659在融合FH8标签后，其表达水平明显高于全长BTK蛋白，纯化产量也显著提升。这说明在无细胞蛋白表达体系中，合理优化蛋白结构域以及可溶性标签，能够明显改善蛋白表达效率与稳定性。

图2：利用eProtein Discovery系统对BTK变体进行表达与纯化筛选

通过同时筛选不同标签与不同表达条件，研究人员能够快速找到更适合SPR分析的蛋白构建方案，从而避免传统蛋白表达过程中大量重复优化工作。

五、Avi标签位置优化与蛋白规模放大

在确定BTK392-659为最佳构建体后，研究人员进一步将Avi标签分别置于蛋白N端和C端，并再次利用eProtein Discovery系统进行筛选，以评估标签位置对于蛋白表达和后续功能分析的影响。

结果显示，虽然加入Avi标签后蛋白表达量略有下降，但标签位置并未对整体纯化产量产生明显负面影响。同时，研究发现ZZ标签相比FH8标签能够进一步提高目标蛋白产量，这也说明不同标签组合对蛋白表达结果具有明显影响。

图3：带Avi标签BTK蛋白的表达与纯化筛选结果

随后，研究人员对筛选得到的最佳条件进行规模放大生产，并成功获得高纯度BTK蛋白。

图4：规模放大生产后的BTK蛋白SDS-PAGE分析结果

六、生物素化修饰与SPR动力学分析

为了进一步开展SPR实验，研究人员使用BirA连接酶对带Avi标签的BTK蛋白进行生物素化修饰，并通过缓冲液交换去除多余生物素。

Western blot结果显示，无论Avi标签位于N端还是C端，目标蛋白均能够成功完成生物素化。

图5：BTK蛋白生物素化分析结果

随后，研究人员利用Biacore SPR系统对不同BTK变体进行捕获分析。实验发现，N端生物素化BTK在Sensor Chip SA芯片上的捕获效率明显优于C端生物素化BTK，说明标签位置会直接影响SPR实验表现。

进一步的动力学实验表明，fenebrutinib与vecabrutinib均能够与BTK蛋白发生有效结合，说明通过eProtein Discovery系统表达获得的BTK蛋白具备良好的功能活性。

图6：Biacore SPR动力学分析结果

七、总结

本研究展示了一套基于Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达系统与Biacore SPR技术结合的BTK抑制剂筛选工作流程。通过对BTK构建体、可溶性标签以及表达条件进行系统筛选，研究人员能够在较短时间内获得适用于SPR分析的高质量功能蛋白，并进一步完成动力学表征。

相比传统蛋白表达与纯化流程，这种基于无细胞蛋白表达平台的工作模式能够明显缩短研发周期，提高蛋白表达优化效率，并帮助研究人员更快完成激酶药物筛选与先导化合物评估。

关于技术来源
本文基于无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成、cell-free system等相关公开科研资料、参考文献、应用文章等曼博生物整理，用于科研技术交流和实验、研发参考。